基因型

F- mcrA mcrB, IN(rrnD-rrnE)1 rnc14::Tn10(DE3lavUV5::T7polymerase)

簡(jiǎn)要說(shuō)明

HT115(DE3)菌株是一類特殊的RNase III缺陷型大腸桿菌菌株，可以飼喂線蟲(chóng)，主要用于秀麗隱桿線蟲(chóng)（C. elegans）的RNAi干擾試驗(yàn)。該菌株可以在LB或2YT培養(yǎng)基中正常生長(zhǎng)，Tn10轉(zhuǎn)座子的存在使其具有四環(huán)素抗性。該菌株染色體整合了λ噬菌體DE3區(qū) (DE3區(qū)含有T7噬菌體RNA聚合酶，在IPTG存在時(shí)可誘導(dǎo)T7RNA聚合酶大量表達(dá)，進(jìn)而啟動(dòng)線蟲(chóng)ds RNA的表達(dá))，可同時(shí)表達(dá)T7 RNA聚合酶和大腸桿菌RNA聚合酶，除了用于線蟲(chóng)RNAi干擾試驗(yàn)，也可用于pET系列，pGEX，pMAL等質(zhì)粒的蛋白表達(dá)。HT115(DE3)感受態(tài)細(xì)胞由特殊工藝制作，pUC19質(zhì)粒檢測(cè)轉(zhuǎn)化效率達(dá)0.5×108 cfu/μg DNA。

操作說(shuō)明

1、HT115(DE3)感受態(tài)細(xì)胞從-80℃拿出，迅速插入冰中，5分鐘后待菌塊融化，加入目的質(zhì)粒并用手撥EP管底輕輕混勻(避免用槍吸打)，冰中靜置25分鐘。

2.42℃水浴熱激45秒，迅速放回冰中并靜置2分鐘，晃動(dòng)會(huì)降低轉(zhuǎn)化效率。

 3.向離心管中加入700 μl不含抗生素的LB無(wú)菌培養(yǎng)液，37℃，200 rpm復(fù)蘇60分鐘。

 4.5000 rpm離心一分鐘收菌，留取50 μl左右上清輕輕吹打重懸菌塊并涂布到含相應(yīng)抗生素的LB培養(yǎng)基上。

5.將平板倒置放于37℃培養(yǎng)箱過(guò)夜培養(yǎng)。

注意事項(xiàng)

1、感受態(tài)細(xì)胞最好在冰中緩慢融化，插入冰中8分鐘內(nèi)加入目標(biāo)DNA，不可在冰中放置時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，長(zhǎng)時(shí)間存放會(huì)降低轉(zhuǎn)化效率。

2. 轉(zhuǎn)化高濃度的質(zhì)?？上鄳?yīng)減少最終用于涂板的菌量。

3. 誘導(dǎo)時(shí)，IPTG濃度可根據(jù)實(shí)驗(yàn)選擇使用（0.1-10mM）。

4. 進(jìn)行線蟲(chóng)RNAi質(zhì)粒轉(zhuǎn)化時(shí)，抗生素使用濃度可參考：氨芐—50ug/ml，四環(huán)素—12.5ug/ml。

5. 若進(jìn)行蛋白表達(dá)，為獲得需要量的蛋白，最佳誘導(dǎo)時(shí)間，溫度，IPTG濃度需實(shí)驗(yàn)者優(yōu)化。